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爱赢平台遗传研究相关组织收集和储存指南

在DNA库中收集和保存植物组织可以作为一个物种遗传物质的长期仓库, 促进一系列的遗传研究(系统发育的, 人口的遗传, 以及保护基因研究)的未来. 来保持DNA采集的完整性, 为了防止核酸酶降解,需要适当的长期储存, 氧化, 水解, 和电离辐射1,2. 植物组织或DNA提取物的质量可以通过低温保存得到最好的保持, 物料储存在液氮气相(-180°C以下), 分子运动显著减慢的温度. 因为液氮本身是冷的, 与超低温冷冻机相比,液氮冷冻机的机械故障和电力中断问题更小3. 然而,对许多机构来说,低温保存在经济上或后勤上都不可行.

作为超低温保存的替代品, 机构可选择将组织采集保持在干燥或冷冻(-20°C或-80°C)状态. 硅胶是一种常用的干燥剂,可用于快速、方便地干燥植物材料,以提取DNA6. 如果使用硅胶, 植物组织应尽快干燥,以减缓DNA降解. 而干燥的组织可以用二氧化硅在密闭容器中保存在室温下, 至少短期内是这样5Hodkinson等人. (2007)建议将干燥的植物材料保存在-20°C的冰箱中, 密苏里植物园也采用了这种做法7. 另一方面,史密森学会(Smithsonian Institution)将干燥的纸巾储存在-80°C. 缺乏评估在不同温度下储存干燥组织的长期影响的研究, 尽管“越冷越好”通常是对新鲜组织和DNA提取的推荐. 避免将组织长期储存在报纸或其他酸性物质中,可以进一步保持DNA质量, 在潮湿的环境, 与光接触, 所有这些都会降解DNA5. 将组织储存在密封容器中尤为重要, 因为储存在密封不良的容器中会降低DNA的质量5.

在冰箱中保存新鲜的植物材料是长期保存组织的另一种可行的爱赢平台app. 应避免通过温度循环的无霜冻机, 因为温度波动会导致DNA损伤或蛋白质退化8. 为了提取DNA,许多植物组织应在-70°C至-80°C长期稳定储存, 核糖核酸, 和蛋白质, 而在-20°C9时可发生降解. 然而,Neubig等人. (2014)发现冷冻24年的植物材料,无论组织在-20°C或-80°C保存在粉碎或完整的状态下,都能保持高质量5. 储存在-80°C可能是明智的选择,以增加样品的分子完整性. 因为-80°C的冰柜很容易发生机械或电气故障3应配备适当的报警系统和备份存储空间.

如果时间, 空间, 和爱赢平台app允许, 实验室设备除了储存组织标本外,还可以选择储存DNA提取物, 因为DNA样本比组织更稳定. DNA提取物通常存储在TE (Tris EDTA)中。2,9 缓冲液,防止污染的细菌和降解的核酸酶10. 减少冻融循环次数,从而使DNA质量恶化, 经常访问的样品可保存在-20°C的均分中, 而档案摘录可以保存在-80°C1,2,11. 在一项研究中,探讨了兰花叶样品的最佳储存与干燥的二氧化硅, 从组织中提取的DNA在-20℃保存7 - 12年的质量略高于从组织中提取的DNA在无二氧化硅的黑暗中保存相同时间的质量. DNA提取液在-18℃保存时可用于PCR 4 - 7年,在-80℃保存时可用于PCR 4年以上1. 在评估了各种储存缓冲液和温度之后, Smith和Morin(2005)发现,在-80°C保存或在室温用海藻糖干燥时,DNA产量最高12. 最高的DNA质量, 另一方面, 用海藻糖干燥或在-80°C, 而在20°C和4°C的存储条件下,质量会下降. 就像植物组织一样, 在液氮温度下储存是保存最高质量的提取物的最佳条件2. 而, DNA提取物可以更好地保存DNA的完整性, 仍然值得保持组织冷藏,这将允许更广泛的下游分子研究. 大多数DNA库存储组织(或细胞),只根据要求提取DNA1.

核糖核酸-Seq是基因组学中一个新兴的领域,它允许人们检查基因组的基因编码部分,并评估不同治疗组之间的基因表达差异. 因此,实验室除了可以提取DNA,还可以选择储存用于核糖核酸的组织. 组织通常用液氮快速冷冻,保存在-80°C或液氮温度下.

核酸储存爱赢平台app有很多种, 其中许多内容超出了本文档的范围. 长期保存植物组织样本的爱赢平台app有硅胶干燥法和-80°C速冻组织储存法. 以下爱赢平台app保存植物材料的建议主要基于史密森学会的指导方针13 以及全球基因组计划14, 为提取DNA或核糖核酸的植物组织的收集和存储提供了一个优秀的工作流程. 这些指南包括在-80°C下长期保存硅胶干燥和快速冷冻的植物组织. 我将在下面对这些指导方针进行总结和扩展,并请读者参考这些资料以作进一步参考.

组织干燥和储存

使用硅胶干燥剂

而干燥植物组织有许多潜在的试剂4, 硅胶是一种常用的干燥剂,可以轻松快速地干燥植物组织,用于提取DNA4,6. 硅胶可以充当皮肤, 眼睛, 和呼吸道刺激, 因此需要适当的个人防护装备(手套), 口罩, 当使用二氧化硅时,应佩戴护目镜(请参阅特定产品的安全数据表)。. 硅胶可在各种尺寸的筛网, 在哪里更细的等级(28 - 200目)可以更快地干燥组织由于更大的表面积体积比. 然而, 更大的等级(2 - 4毫米粒径)应该足够干燥, 而且比小型网眼更便宜,更不容易被吸入13.

指示硅胶改变颜色时,饱和,因此可以用来信号时,改变硅胶是必需的. 建议比例为1:10指示:非指示(白色)硅胶13. 有三种指示硅胶可供选择(颜色从橙色到透明/白色, 橙色,绿色, 或饱和时从蓝色变为粉红色). 橙色到透明/白色的珠子是推荐的,因为它们的毒性最小13. 一旦饱和,硅胶可以通过加热在植物干燥器中干燥再利用. 按照制造商的说明重新干燥珠.

收集、干燥和储存植物组织

收集什么. 年轻的, 积极生长的叶片组织最适合提取DNA, 尽管非常年轻的脆弱组织应该避免13. 年轻的组织比老的组织更好,因为它每体积有更多的细胞13,不太可能被内生真菌殖民13, 而且不太可能有干扰DNA提取和抑制下游PCR反应的二级化合物. 也可以从嫩枝、根、种子、花粉或配子体中提取DNA9.

要收集多少组织. 从15个距离较远的个体(见样本大小部分),每株收集3 - 5片叶子7 (或10 - 25cm2的叶片材料,爱赢平台大叶片的种13),只要对植物无害. 因为叶片厚度会因物种而异, 另一个有用的指南可能是收集至少100毫克的新鲜组织, 如果对植物无害的话. DNA提取一般需要50毫克至100毫克以下的湿组织样本(或20毫克以下的干组织样本)15, 如果需要优化提取方案,最好有额外的材料来工作. 因此,100mg的湿组织可以提供足够的材料进行两次提取. 这个量可以根据使用的DNA提取协议推荐的起始组织量进行调整.

如何收集组织. 避免DNA降解, 建议尽快将组织干燥, 最好是12 - 48小时13,虽然12小时以内是最理想的. 这可以通过用二氧化硅储存样品来实现, 硅胶与叶片组织的比例至少为10:15,6,尽管叶片厚或含水量高的物种可能需要更多的二氧化硅. 干燥应在环境温度较低的地方进行13. 叶片组织可以按样品放置在单独的硬币信封(2¼x 3½英寸)中13,贴上样本名称、日期、种类、收集地点及收集者的标签. 推荐使用白色投币信封, 这是一种比棕色信封酸性更弱(因此对DNA的降解性更弱)的信封13. 然后将信封放入密封的Ziploc塑料袋与硅胶干燥剂的适当比例的组织储存. 多个信封可以储存在同一个密封保鲜袋, 最好按收集位置分组, 如果需要的话,可以用档案回形针来固定信封. 另外, 样品可以收集成小的, 每个样品可密封聚乙烯袋(2¼x 3½英寸), 用硅氧烷单独配制. 尽管组织可能干得更快, 缺点是当样品准备永久储存时,二氧化硅需要很长时间才能去除,而且二氧化硅不能重复使用(以防止污染)13. 见Funk等人. (2017)查询产品及供应商清单.

确定样品是否已充分干燥, 样品可以在所需的干燥时间过去后进行检查.g. 12小时). 如果样品在弯曲时折断干净,则样品足够干燥. 此时,除少量二氧化硅外,大多数二氧化硅都可以被除去6,因为使用硅胶的组织过度储存会导致DNA降解9. 为了优化干燥过程,可以按照Funk等人的建议,采用多种做法. (2017). 明智的做法是周期性地移动珠子,以最大限度地与叶片组织接触. 将叶子放入信封时, 把叶子撒在信封上, 因为堆放可以防止内部叶子干燥. 把特别厚的或蜡状的叶子切成小片,以最大限度地增加干燥的表面积5. 对于非常大的厚的肋骨, 用剪刀将叶子剪掉,以免叶子被撕裂, 可以释放降解DNA7的酶. 样品间用70%乙醇清洁剪刀,防止交叉污染.

长期储存. 一旦组织完全干燥, 大多数二氧化硅可以去除,样品可以放置在长期储存条件下. 样品储存在-80°C13如果没有超冷冷冻机,则在-20°C7、10或室温下保存4 在不透明的密闭容器中. 硬币信封或Ziplocs可以储存在装有少量二氧化硅的盒子里,以吸收任何多余的水分9,13. 史密森学会推荐洛克 & 锁箱(HPL 836),并包括一个相对湿度指示器卡(吸附剂系统)在每个盒子中监测湿度, 哪些不应超过30%13.

快速冷冻和储存组织样本

用液氮快速冷冻组织样本,并将其保存在-80°C的冰箱中是保存高质量DNA或核糖核酸的另一种爱赢平台app. 组织可收集在8ml低温管(外螺纹o形圈)13,贴上适当的样本及收集资料标签. 低温瓶放置在收集地点的液氮储存杜瓦瓶中,并被运送到实验室,在-80°C的冷冻箱中保存. 如果冷冻样本用于核糖核酸保存, 采取额外清洁程序, 包括戴实验室手套,对样品之间的所有工具进行适当消毒,以尽量减少核酸酶暴露. 因为核糖核酸降解快,基因表达变化快, 样品采集后应尽快放入液氮中. 一定要穿戴合适的个人防护装备(护目镜), 低温手套, 长裤, 遮住脚趾的鞋子, (实验服)在使用液氮时. 作为一种替代液氮工作的爱赢平台app,样本也可以在以后保存在核糖核酸中.

样本大小

DNA. 每个群体收集多个样本为未来的群体遗传分析(例如,每个群体收集多个样本)提供了可能性.g., 评估遗传多样性, 基因流, 人口结构, 人口分配, 神秘的物种, 信号的选择, 等). 传统上,研究人员建议每个人群收集尽可能多的样本. 然而, 最近的一些研究表明,随着单核苷酸多态性(SNPs)数量的增加,可以通过下一代测序进行分析, 在每个人口中取样较少的个体是可能的16–18. 通过对经验数据的模拟,Nazareno等. (2017)发现6 - 8个样本足以获得准确的自不相容多样性估计, 当考虑1000个SNPs时,亚马逊植物物种的异交17. 同样,Willing等人. (2012)发现4 - 6个样本和超过1000个SNPs可以充分估计一个模拟数据集的遗传分化, 但建议对离群值分析需要10个以上的样本16. 不过, 最近的一个模拟比较了样本大小和序列深度的权衡,鼓励尽可能多的个体进行采样,而代价是降低序列覆盖率, 为了准确估计遗传多样性,计算种群分化统计量19.

对群体遗传研究感兴趣的机构, 我们建议从每个人口15人的抽样目标开始, 前提是有足够数目的个人可供收集,而这些收集不会对种群造成伤害. 然而,理想的样本大小将取决于研究的具体目标(例如.g. 需要的遗传估计类型)和感兴趣物种的生活史(人口统计学历史), 交配系统, 花粉和种子传播综合症, 等)17. 收集到的个体应该在空间上距离较远,因此更有可能代表群体的遗传组成.

核糖核酸. 收集核糖核酸样本既费力又费时. 实验室可以选择为每个种群或物种收集一个样本来保存核糖核酸, 并根据具体研究的需要,按人口数量收集额外的样本. 每个物种至少有一个样本将允许创建一个参考转录组, 哪些可能对识别基因和变异有用,并可能促进未来的研究.

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2. 李,年代. B.克劳斯C. A. & 克莱恩,M. C. 优化DNA提取物的储存和处理. 《爱赢平台app》19-38 (CRC出版社,2010). doi: 10.1201/b15361-4.

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